一、試驗(yàn)前準(zhǔn)備

菌株與藥物準(zhǔn)備

菌株分離純化：從臨床樣本（如痰液、血液、皮膚鱗屑）或環(huán)境樣本中分離目標(biāo)真菌（如白色念珠菌、曲霉菌），在霉菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行純化培養(yǎng)（溫度設(shè)置為 25~30℃，濕度 60%~80%，避光培養(yǎng) 3~7 天），獲得單菌落。

藥物配置：選取臨床常用抗真菌藥物（如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素 B），配置成系列濃度梯度的藥液，稀釋至試驗(yàn)所需濃度范圍（參考 CLSI 或 EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)）。

培養(yǎng)基與耗材準(zhǔn)備

選用適合真菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，如沙堡葡萄糖瓊脂（SDA） 或RPMI 1640 液體培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基更適合定量檢測(cè)）。

準(zhǔn)備無菌 96 孔板、接種環(huán)、移液器等耗材，確保無菌操作。

霉菌培養(yǎng)箱參數(shù)校準(zhǔn)

根據(jù)真菌種類設(shè)置溫度：酵母類真菌（如念珠菌）一般 35℃，絲狀真菌（如曲霉菌）一般 28℃。

調(diào)節(jié)濕度至 70% 左右，部分真菌需設(shè)置光照周期（如某些皮膚癬菌），培養(yǎng)箱內(nèi)需定期消毒，避免污染。

二、抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)操作步驟

以微量肉湯稀釋法（CLSI M27-A4 標(biāo)準(zhǔn)，適用于酵母樣真菌）為例：

菌懸液制備

挑取純化后的真菌單菌落，接種于 RPMI 1640 液體培養(yǎng)基中，在霉菌培養(yǎng)箱中 35℃振蕩培養(yǎng) 2~4 小時(shí)，調(diào)整菌懸液濃度至 1×10? CFU/mL（麥?zhǔn)媳葷岱ㄐ?zhǔn)）。

藥物與菌液加樣

在 96 孔板中加入系列濃度梯度的抗真菌藥液，每孔 100μL；再加入調(diào)整好濃度的菌懸液，每孔 100μL，使藥物終濃度覆蓋從亞抑菌濃度到超抑菌濃度的范圍。

設(shè)置對(duì)照組：陽性對(duì)照組（只加菌懸液，不加藥物）、陰性對(duì)照組（只加培養(yǎng)基，不加菌液和藥物）。

恒溫培養(yǎng)

將 96 孔板密封后放入霉菌培養(yǎng)箱，35℃恒溫培養(yǎng) 24~48 小時(shí)（酵母類真菌 24h，絲狀真菌 48~72h），期間避免開蓋，防止污染和藥物揮發(fā)。

三、耐藥性判定與結(jié)果讀取

抑菌濃度（MIC）測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后，觀察 96 孔板中真菌生長(zhǎng)情況：以無肉眼可見真菌生長(zhǎng)的藥物濃度為該菌株的 MIC 值。

對(duì)比 CLSI 或 EUCAST 的折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，判斷菌株耐藥性：

敏感（S）：MIC ≤ 敏感折點(diǎn)，臨床治療有效；

中介（I）：MIC 在敏感和耐藥折點(diǎn)之間，治療反應(yīng)不確定；

耐藥（R）：MIC ≥ 耐藥折點(diǎn)，臨床治療無效。

殺菌濃度（MBC）測(cè)定（可選）

取無生長(zhǎng)孔中的培養(yǎng)液，涂布于 SDA 平板上，在霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24~48 小時(shí)，以殺滅 99.9% 真菌的藥物濃度為 MBC 值，輔助判斷藥物殺菌效果。

四、真菌耐藥性流行趨勢(shì)監(jiān)測(cè)

菌株收集與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

長(zhǎng)期收集不同地區(qū)、不同來源（臨床 / 環(huán)境）、不同時(shí)間段的真菌菌株，統(tǒng)一開展藥敏試驗(yàn)，記錄每株菌對(duì)不同藥物的 MIC 值和耐藥性分類。

建立數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計(jì)耐藥率（耐藥菌株數(shù) / 總菌株數(shù) ×100%）、MIC??（抑制 50% 菌株生長(zhǎng)的藥物濃度）、MIC??（抑制 90% 菌株生長(zhǎng)的藥物濃度）。

趨勢(shì)分析維度

時(shí)間維度：對(duì)比不同年份、季節(jié)的耐藥率變化，判斷耐藥性是否逐年上升；

地域維度：分析不同地區(qū)的耐藥譜差異，明確高耐藥區(qū)域；

藥物維度：統(tǒng)計(jì)不同抗真菌藥物的耐藥率，篩選優(yōu)勢(shì)耐藥藥物種類；

菌株維度：關(guān)注特定真菌菌種（如克柔念珠菌、煙曲霉）的耐藥特征，識(shí)別新型耐藥菌株。

數(shù)據(jù)驗(yàn)證與發(fā)布

對(duì)耐藥率異常升高的菌株進(jìn)行基因測(cè)序，驗(yàn)證是否存在耐藥基因突變（如 ERG11 基因突變與氟康唑耐藥相關(guān)）；

結(jié)合臨床用藥數(shù)據(jù)，分析耐藥性與藥物使用頻率的相關(guān)性，為臨床合理用藥和耐藥性防控提供依據(jù)。

五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

標(biāo)準(zhǔn)化操作：嚴(yán)格遵循 CLSI/EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)，確保菌株純化、藥物濃度、培養(yǎng)條件的一致性，否則會(huì)導(dǎo)致 MIC 值偏差。

污染控制：霉菌培養(yǎng)箱需定期用紫外線或過氧化氫消毒，操作全程無菌，避免雜菌干擾試驗(yàn)結(jié)果。

質(zhì)量控制：每次試驗(yàn)需加入質(zhì)控菌株（如白色念珠菌 ATCC 90028），驗(yàn)證試驗(yàn)體系的準(zhǔn)確性。

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