外泌體制備，便宜又好用的方法

外泌小體（Exosome）是一種囊泡結(jié)構(gòu)，直徑通常在30-150nm，常見(jiàn)于正常體液和病理樣本，培養(yǎng)細(xì)胞也可分泌。研究人員已經(jīng)在血液、唾液、尿液、母乳等中發(fā)現(xiàn)外泌小體，其運(yùn)載的蛋白和核酸涉及其細(xì)胞間物資、信息交流，影響和調(diào)控著多方面的生理功能，包括腫瘤發(fā)生、免疫促進(jìn)、凋亡調(diào)控、血管生成、炎癥反應(yīng)及發(fā)育和分化 等。由于在體液中出現(xiàn)，外泌小體對(duì)于臨床生物標(biāo)志物檢測(cè)特別有 利，成為體外診斷、biomarker研究的新熱點(diǎn)。

近年來(lái)隨著分離純化技術(shù)的提高，關(guān)于外泌小體的研究成果頗豐；這進(jìn)一步吸引了越來(lái)越多領(lǐng)域的課題將外泌體納入研究對(duì)象。研究的前提是方便、高效、標(biāo)準(zhǔn)化地分離純化外泌小體。經(jīng)過(guò)近20年的探索，已經(jīng)建立了超速離心法、沉淀法、色譜法、親和純化法等。在大量實(shí)踐中大家逐漸認(rèn)識(shí)到根據(jù)下游研究對(duì)樣品的要求，以及起始樣品的規(guī)模、數(shù)量，可以選擇不同的外泌體制備策略。因不需要特殊的設(shè)備和試劑盒，對(duì)操作人員也沒(méi)有特別的經(jīng)驗(yàn)要求，超濾法成為實(shí)驗(yàn)室中制備外泌體的通用方法。

參考方案

兩步法細(xì)胞上清的外泌體分離

超濾方法純化具體操作步驟舉例

Amicon® Ultra-15 超濾管 (10 kDa MWCO)

● 用Steriflip真空抽濾對(duì)樣品進(jìn)行澄清[目錄號(hào) SCGPO0525; 0.22um Millipore Express PLUS (PES)膜]

● 用PBS平衡Amicon Ultra-15超濾管( 目錄號(hào)UFC901096，10kDa) ，離心 4000g X 10 min。

● 從超濾管內(nèi)管及收集管吸走 PBS。

● 向超濾管加入15mL 樣品。

●  4000g 離心30min.濃縮。

●  倒空收集管。

●  加入14 mL PBS進(jìn)行緩沖液置換，溫柔吸打樣品數(shù)次。

●  4000g離心30 min。

●  從濃縮管吸回處理好的樣品。(30X 濃縮)

注意: 所有 Amicon  ultra 超濾管(0.5,2,4 和15 mL)與此操作流程兼容*

注意事項(xiàng)及補(bǔ)充提示

● 無(wú)血清樣品選擇 3kDa 孔徑是為了盡可能提高外泌體的回收率。

● 有血清樣品選擇 100kDa/500kDa 孔徑是為了盡可能去除細(xì)胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌體的白蛋白造成的影響。

● 研究者可根據(jù)樣品的粘稠程度，以及需要制備的目標(biāo)外泌體 / 囊泡 / 顆粒的大小分布來(lái)選擇和優(yōu)化超濾孔徑(3kDa/ 10kDa/ 30kDa/ 50kDa/ 100kDa)，以便達(dá)到更好的得率和操作體驗(yàn)。

● 樣品體積大于 30mL 時(shí)可以考慮用超濾杯或 Centricon plus -70 超管，請(qǐng)注意攪拌式超濾杯在 200mL 以內(nèi)時(shí)吸附損

耗可能較離心式超濾管略偏高。

● 如需進(jìn)一步提高特定外泌體的純度，可選用包被相應(yīng)抗體的磁珠進(jìn)行親和純化精制。

不同方法制備外泌小體產(chǎn)量比較

超濾法制備的外泌小體參考數(shù)據(jù)

多維度分析4 個(gè)SH-SY-5Y 細(xì)胞系的外泌小體樣品

(含或不含血清)

默克生命科學(xué)過(guò)濾超濾產(chǎn)品組合