ICG 標(biāo)記多肽的核心是通過(guò)氨基（或巰基）偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，關(guān)鍵在于控制反應(yīng)條件和高效純化。

一、實(shí)驗(yàn)核心準(zhǔn)備

1. 試劑準(zhǔn)備：純度≥95% 的目標(biāo)多肽（含游離氨基 / 巰基）、ICG-NHS 酯（或 ICG - 馬來(lái)酰亞胺，匹配多肽反應(yīng)基團(tuán)）、無(wú)水 DMSO、無(wú)氨基緩沖液（如 PBS pH 7.2-7.4）、淬滅劑（如甘氨酸）。

2. 器材準(zhǔn)備：避光離心管、磁力攪拌器、透析袋（MWCO 3.5-10 kDa）或 HPLC 系統(tǒng)、冷凍干燥機(jī)、紫外 - 可見(jiàn)分光光度計(jì)。

3. 多肽預(yù)處理：用無(wú)水 DMSO 溶解多肽，濃度調(diào)整為 1-10 mg/mL，確保無(wú)水分干擾反應(yīng)。

二、標(biāo)記反應(yīng)步驟

1. 按多肽與 ICG 摩爾比 1:1.2-1:2 投料，將 ICG-NHS 酯用少量無(wú)水 DMSO 溶解后，緩慢滴入多肽溶液。

2. 室溫下避光攪拌反應(yīng) 2-4 小時(shí)，或 4℃過(guò)夜，全程避免光照和氧氣接觸。

3. 加入過(guò)量甘氨酸（終濃度 10 mM），繼續(xù)攪拌 30 分鐘，淬滅未反應(yīng)的 ICG 活性基團(tuán)。

三、產(chǎn)物純化與收集

1. 透析法：將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋，用 PBS 緩沖液 4℃避光透析 24-48 小時(shí)，每 6-8 小時(shí)更換一次緩沖液，去除游離 ICG。

2. 高效液相色譜（HPLC）法：采用反相 C18 柱，以乙腈 - 水（含 0.1%TFA）為流動(dòng)相梯度洗脫，收集目標(biāo)峰（通過(guò) 280 nm 和 780 nm 雙波長(zhǎng)檢測(cè)確認(rèn)）。

3. 冷凍干燥：將純化后的溶液冷凍干燥，得到 ICG 標(biāo)記多肽粉末，避光密封保存。

四、關(guān)鍵驗(yàn)證步驟

1. 純度檢測(cè)：HPLC 檢測(cè)目標(biāo)峰純度≥90%，無(wú)明顯游離 ICG 雜峰。

2. 標(biāo)記率計(jì)算：通過(guò)紫外 - 可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定 280 nm（多肽）和 780 nm（ICG）吸光度，按公式計(jì)算標(biāo)記率（理想值 0.8-1.2）。

3. 穩(wěn)定性驗(yàn)證：將標(biāo)記產(chǎn)物溶于 PBS，4℃避光放置 1 周，檢測(cè)吸光度變化，確認(rèn)無(wú)明顯降解。