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免疫組化實驗步驟及問題解答
閱讀：1227 發(fā)布時間：2024-2-5免疫組化基本原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究。
1、脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
a 、組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b 、無水乙醇中浸泡五分鐘
c 、95%乙醇中浸泡五分鐘
d、 75%乙醇中浸泡五分鐘
2、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：
A 、抗原熱修復(fù)
a 、高壓熱修復(fù)： 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（ph6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。
b、 沸熱修復(fù)：電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。
c、 微波爐加熱：在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等。
B、 酶消化方法：
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
免疫組化問題解答：
1、染色過強
a 、抗體濃度過高或孵育時間過長 降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1小時或4度過夜；
b、 孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28度；
c、 DAB顯色時間過長或濃度過高 顯色時間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準。
2、非特異性背景染色
a、 操作過程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3次每次5分鐘；
b、 組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時間延長；
c、 組織中含內(nèi)原性生物素 正常非免疫動物血清再封閉；
d、 血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時間。
3、染色弱
a 、抗體濃度過低、孵育時間過短 提高抗體濃度、孵育時間不能少 于60分鐘；
b、 試劑超過有效使用時間 應(yīng)更換試劑；
c、 操作中添加試劑時緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋 （應(yīng)防止切片干燥）；
d、 室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過夜；
e、 蛋白封閉過度 封閉不要超過12分鐘。
4、染色陰性
a 、操作步驟錯誤 應(yīng)重試 設(shè)陽性對照；
b、 組織中無抗原 設(shè)陽性對照以驗證試驗結(jié)果；
c、 一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗二抗種屬無誤。