LOVO/5FU人結(jié)直腸癌細胞氟尿嘧啶耐藥株

細胞介紹

注：本培養(yǎng)基是不直接添加氟尿嘧啶藥物的。

細胞特性

1） 來源：結(jié)直腸腺癌

2） 形態(tài)：上皮樣   貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用。

LOVO/5FU人結(jié)直腸癌細胞氟尿嘧啶耐藥株

運輸和保存

干冰運輸及復(fù)蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。                      

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

（1）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

（2）*培養(yǎng)基的配制：

①準備F12K（推薦0007) 培養(yǎng)基：優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%；補充F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基至所需體積。

②準備F12K含5-Fu*培養(yǎng)基：優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%；5-Fu：400~1065uM；補充F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基至所需體積。

（3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：

① 細胞在傳代和剛復(fù)蘇時較為脆弱，中止液須為不含5-Fu的*培養(yǎng)基，且在細胞未貼壁期間和貼壁前期需用不含5-Fu的*培養(yǎng)基，待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定時再根據(jù)需要濃度添加5-Fu。

②若細胞生長狀態(tài)較為緩慢時，可適當降低5-Fu的濃度，或使用不含5-Fu的*培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的5-Fu濃度。

二、細胞培養(yǎng)

（1）細胞復(fù)蘇

①將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到37℃；

②準備一支15ml離心管，加入5mL含10%FBS的*培養(yǎng)基，放入37℃水浴鍋中預(yù)熱；

③戴上護目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細胞，盡快轉(zhuǎn)入37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動凍存管以提高復(fù)溫速率；

④將融化了的凍存管中的細胞吸入事先準備的離心管中，混勻后，1000rpm離心5min；

⑤準備一個T25培養(yǎng)瓶，寫上細胞名稱、日期，再加入4mL*培養(yǎng)基；

⑥離心完成后棄去上清，用1mL*培養(yǎng)基重懸細胞后，轉(zhuǎn)入T25細胞培養(yǎng)中，混勻后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。

注意：從液氮中取出細胞凍存管時，若凍存管內(nèi)有液氮進入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。

（2）細胞傳代

①當細胞匯合度達到85%以上時，可進行傳代；

②在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶內(nèi)的培養(yǎng)基；

③向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入3mL無菌的1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使PBS能夠浸潤到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄PBS；

④向瓶內(nèi)加入消化液1mL（0.25%胰蛋白酶），浸潤底面后放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育3~5min；

⑤孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細胞是否變圓飄起，若全部消化下來則直接向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2mL含10%FBS的*培養(yǎng)基中，將懸液吸入15mL離心管；

注意：如還有部分細胞未消化下來，可采用分步消化：

a. 準備一個無菌的15mL離心管，加入2mL含10%FBS的*培養(yǎng)基；

b.將消化下來的細胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；

c.向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶繼續(xù)消化2min左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細胞脫落后加入2mL含10%FBS的*培養(yǎng)基中和，中和后的細胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。

⑥1000rpm離心5min；

⑦準備兩個新的T25培養(yǎng)瓶，各加入4mL*培養(yǎng)基；

⑧離心完成后，棄上清，用2mL*培養(yǎng)基重懸離心細胞，將重懸后的細胞轉(zhuǎn)入2個T25培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶各1mL；

⑨水平放置培養(yǎng)瓶，震蕩混勻后將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

（3）細胞凍存  （注意：細胞凍存建議每瓶T25凍一支）

①~⑥請參照傳代步驟；

⑦離完成后，棄上清，用1mL凍存液重懸細胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入1.8mL凍存管中；

⑧將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過夜降溫；

⑨第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

1.收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩(wěn)定細胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據(jù)。

3.由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶收到細胞后一周內(nèi)的細胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

4.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。