高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸熒光PCR檢測試劑盒
前言
本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，是針對(duì)豬藍(lán)耳病毒設(shè)計(jì)的檢測體系，用于豬血清和組織等樣本的檢測。
試劑盒組成成分
組成成份（48Tests/kit） | 規(guī)格 |
核酸擴(kuò)增試劑 |
|
RT-PCR反應(yīng)液 | 994.5µl×1管 |
Taq酶(5U/µl) | 15.5µl×1管 |
Enhancer | 10.5µl×1管 |
對(duì)照品 |
|
陰性對(duì)照 | 25µl×1管 |
陽性對(duì)照 | 25µl×1管 |
儲(chǔ)存條件及有效期
本試劑盒貯存于-20℃的條件下有效期為6個(gè)月。
適用儀器(熒光PCR檢測儀)
Ø ABI公司Prism7000、7300、7500系列
Ø RotorGene系列
Ø Bio-Rad公司的iCycler系列
【自備試劑】
核酸提取試劑。
【樣本采集、存放及運(yùn)輸】
1．樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集。
2．存放：分離后的血清或血漿樣本在2℃—8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）。
3．運(yùn)輸：采用冰hu或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
【檢驗(yàn)方法】
1．樣本處理（樣本處理區(qū)）：
用戶可采用病毒RNA提取試劑盒提取RNA用于檢測或保存與-20℃（-80℃更佳）以待檢測。說明：陽性對(duì)照及陰性對(duì)照無需提取，直接上樣。
2．擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）：
從試劑盒中取出RT-PCR 反應(yīng)液、Taq酶及PCR Enhancer，室溫融化并振蕩混勻后，2000rpm離心10秒。設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為n（n = 樣本數(shù) + 1管陰性對(duì)照 + 1管陽性對(duì)照），每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | RT-PCR反應(yīng)液 | Taq酶 | PCR enchancer |
用量 | 19.5 µl | 0.3ul | 0.2 µl |
計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積離心管中，充分混合均勻，2000rpm離心10秒，向設(shè)定的n個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入20 µl，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
3．加樣（樣本處理區(qū)）：
向所設(shè)定的n個(gè)PCR 反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照各5µl，蓋緊管蓋，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。將PCR反應(yīng)管排好放入PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。
4．PCR擴(kuò)增（檢測區(qū)）
4.1 循環(huán)條件設(shè)置
50℃：30 min；
95℃：3 min；
95℃：10 sec, 60℃: 1min 40個(gè)循環(huán)。
熒光信號(hào)收集設(shè)在60℃。反應(yīng)體系設(shè)為25ul。
4.2 儀器檢測通道選擇
待測熒光為FAM熒光素，熒光PCR檢測儀熒光信號(hào)收集設(shè)定為FAM熒光素。
5．結(jié)果分析條件設(shè)定：
5.1 閾值(threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照曲線（無規(guī)則的噪音線）的高點(diǎn)為準(zhǔn)。
5.2 基線（baseline）應(yīng)選擇該次實(shí)驗(yàn)指數(shù)擴(kuò)增前所有樣本熒光信號(hào)比較穩(wěn)定的一段區(qū)域（所有樣本熒光信號(hào)無較大波動(dòng)），起始點(diǎn)（循環(huán)數(shù)）應(yīng)避開熒光采集起始階段的信號(hào)波動(dòng)，終止點(diǎn)（循環(huán)數(shù)）應(yīng)比早出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的樣本Ct值減少1-2個(gè)循環(huán)。
注：具體設(shè)置方法請(qǐng)參照各儀器使用說明書。
6．質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：
陰性對(duì)照的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性；
陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于32.0。
1．結(jié)果判斷：
Ø Ct值無讀數(shù)的樣本為陰性。
Ø Ct值≤38.0的樣本為陽性。
Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。
重做結(jié)果Ct值＜40.0為陽性，否則為陰性。
【試劑盒使用注意事項(xiàng)】
1. 有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請(qǐng)嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實(shí)驗(yàn)請(qǐng)嚴(yán)格分區(qū)操作：
*區(qū)：PCR前準(zhǔn)備區(qū)——準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑；
第二區(qū)：樣本處理區(qū)——待測樣本和對(duì)照品處理；
第三區(qū)：檢測區(qū)——PCR擴(kuò)增檢測。
4. 各區(qū)物品均為，不得交叉使用，避免污染，實(shí)驗(yàn)后即請(qǐng)清潔工作臺(tái)。
5. 試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后請(qǐng)稍事離心。
6. 在－20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物，應(yīng)在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)扣蓋或裝入密實(shí)袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。
8. 加樣時(shí)應(yīng)使樣品*落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。
9. 擴(kuò)增完畢立即取出反應(yīng)管，密封在塑料袋內(nèi)，丟棄于地點(diǎn)。
10. 反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。
11. 實(shí)驗(yàn)中用過的吸頭請(qǐng)直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
12. 工作臺(tái)及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。
1．結(jié)果判斷：
Ø Ct值無讀數(shù)的樣本為陰性。
Ø Ct值≤38.0的樣本為陽性。
Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。
重做結(jié)果Ct值＜40.0為陽性，否則為陰性。
【試劑盒使用注意事項(xiàng)】
1. 有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請(qǐng)嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實(shí)驗(yàn)請(qǐng)嚴(yán)格分區(qū)操作：
*區(qū)：PCR前準(zhǔn)備區(qū)——準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑；
第二區(qū)：樣本處理區(qū)——待測樣本和對(duì)照品處理；
第三區(qū)：檢測區(qū)——PCR擴(kuò)增檢測。
4. 各區(qū)物品均為，不得交叉使用，避免污染，實(shí)驗(yàn)后即請(qǐng)清潔工作臺(tái)。
5. 試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后請(qǐng)稍事離心。
6. 在－20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物，應(yīng)在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)扣蓋或裝入密實(shí)袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。
8. 加樣時(shí)應(yīng)使樣品*落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。
9. 擴(kuò)增完畢立即取出反應(yīng)管，密封在塑料袋內(nèi)，丟棄于地點(diǎn)。
10. 反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。
11. 實(shí)驗(yàn)中用過的吸頭請(qǐng)直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
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