革蘭氏陰性菌（GNB）給全球公共衛(wèi)生造成了最嚴(yán)重的問題之一，因?yàn)檫@種細(xì)菌對抗生素有高度耐藥性1，而且會引發(fā)肺炎、血液感染、傷口和手術(shù)部位感染、腦膜炎等感染性疾病2。細(xì)菌內(nèi)毒素是GNB細(xì)胞膜的關(guān)鍵成分，當(dāng)濃度足夠高時(shí)會引發(fā)致熱反應(yīng)（即高燒）。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）要求制藥廠進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（BET，Bacterial Endotoxins Testing），重點(diǎn)測量注射用水（WFI，Water For Injection）、制藥原材料、成品藥、醫(yī)療器械等所有涉及注射用藥物的GNB污染程度。細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法主要有以下3種：1、凝膠法（Gel-Clot），2、動態(tài)濁度法（KTA，Kinetic Turbidimetric Assay），3、動態(tài)顯色法（KCA，Kinetic Chromogenic Assay）。
鱟試劑（LAL，Limulus Amebocyte Lysate）提取自鱟的血液，用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。當(dāng)檢測到內(nèi)毒素時(shí)，鱟試劑級聯(lián)就會有一系列酶促反應(yīng)，酶促反應(yīng)會放大內(nèi)毒素的顯現(xiàn)。當(dāng)內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)時(shí)，內(nèi)毒素會激活酶級聯(lián)中的第一個(gè)因子 — C因子，然后C因子會激活B因子。B因子會作用于凝固酶原，使其成為凝固酶。最后的檢測步驟就是凝固（用凝膠法）、濁度（用動態(tài)濁度法）或顯色（用動態(tài)顯色法）。下圖1是采用動態(tài)顯色法時(shí)鱟試劑級聯(lián)反應(yīng)的示意圖。
圖 1：采用動態(tài)顯色法的鱟試劑級聯(lián)反應(yīng)
LPS：Lipopolysaccharide，脂多糖
Sievers® Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀（以下稱Eclipse）采用動態(tài)顯色法，用405 nm波長（即動態(tài)顯色法的典型波長）來測量和分析內(nèi)毒素的濃度。動態(tài)顯色法使用帶有顯色基底的鱟試劑。顯色基底是一種連接對硝基苯胺（pNA，一種黃色顯色劑）的肽。如果樣品中存在內(nèi)毒素，鱟試劑中的酶促反應(yīng)就會破壞連接pNA的肽鍵，從而在樣品或溶液中釋放黃色。可以用分光光度計(jì)來測量顏色變化，量化色變后可以得出內(nèi)毒素濃度。Eclipse還可以使用Fujifilm Wako濁度試劑，也是用405nm波長來測量內(nèi)毒素濃度。
鱟試劑（LAL）化驗(yàn)易受干擾。樣品中可能含有抑制或增強(qiáng)內(nèi)毒素檢測的物質(zhì)，因此產(chǎn)生假性結(jié)果。需要對待測樣品進(jìn)行方法適用性測試和抑制/增強(qiáng)測試，以確定克服上述干擾所需的稀釋倍數(shù)（或其它有效方法）。
本文概述了如何進(jìn)行抑制/增強(qiáng)測試，如何運(yùn)行此測試來證明Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀的適用性，以及提供運(yùn)行樣品的方法適用性。方法信息包括：所用的鱟試劑化驗(yàn)方法、化驗(yàn)靈敏度（λ）、驗(yàn)證的稀釋倍數(shù)、PPC（陽性產(chǎn)品對照）加標(biāo)濃度、稀釋劑、%CV（變異系數(shù)）標(biāo)準(zhǔn)、以及平均PPC回收率。
樣品信息包括：樣品濃度（單位為mg/mL）、內(nèi)毒素限值（EL，Endotoxin Limit；單位為 EU/mL）、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD，Maximum Valid Dilution）、最小有效濃度（MVC，Minimum Valid Concentration）、平均樣品結(jié)果（單位為EU/mL）、以及樣品儲存/處理?xiàng)l件。
Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀，包括分析儀、微孔板、軟件
鱟試劑（LAL）
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（LRW，LAL Reagent Water）
用于干擾測試的材料（如果需要）：
細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，Control Standard Endotoxin）或細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE，Reference Standard Endotoxin）
不含內(nèi)毒素的稀釋管
不含內(nèi)毒素的移液器吸頭
可調(diào)量程移液器，可進(jìn)行55 μL和1000 μL分液
血清移液器
不含內(nèi)毒素的血清玻璃移液器
渦旋混合器
A
抑制/增強(qiáng)研究：
應(yīng)先進(jìn)行初步的抑制/增強(qiáng)研究，以確定最佳稀釋倍數(shù)，并評估可能存在的干擾。
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B
克服干擾：
干擾測試的要求根據(jù)樣品性質(zhì)而有所不同。鱟試劑化驗(yàn)要求有最佳和特定的活性條件，例如最佳的溫度、pH值、離子強(qiáng)度。大多數(shù)藥品配方適用于患者診治，而非鱟試劑化驗(yàn)。因此大多數(shù)藥品并不符合鱟試劑化驗(yàn)的最佳條件，會對鱟試劑化驗(yàn)有干擾。干擾表現(xiàn)為以下兩種方式之一：抑制或增強(qiáng)。制藥廠應(yīng)當(dāng)非常了解樣品的化學(xué)組成，以便能夠確定干擾源，這非常重要?？梢詤⒖肌懊绹幍?lt;1085>內(nèi)毒素檢測指南（USP <1085> Guidelines on Endotoxins Test）"，以了解常見的干擾及其緩解方法。下表是有關(guān)干擾摘要。
表 1. 常見干擾和緩解方法（摘自USP <1085>）
LPS：Lipopolysaccharide，脂多糖
BET：Bacterial Endotoxins Testing，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測
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04
C
加標(biāo)測試：
加標(biāo)測試是可選程序，旨在進(jìn)一步證明Sievers Eclipse適用于BET測試。此外還要求進(jìn)行加標(biāo)研究，以確定樣品容器適用于測試樣品。
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對新產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時(shí)，應(yīng)執(zhí)行以下程序：
初始的產(chǎn)品評估和稀釋倍數(shù)優(yōu)化
在對新產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測之前，應(yīng)先評估陽性產(chǎn)品對照（PPC）的回收率和變異系數(shù)（%CV），以檢測樣品基質(zhì)所造成的干擾（包括抑制和增強(qiáng)）。此階段的目標(biāo)是確定最佳產(chǎn)品稀釋倍數(shù)，從而將干擾降至可接受的范圍之內(nèi)。最佳稀釋倍數(shù)應(yīng)低于最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）。幾乎所有產(chǎn)品都會干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（BET），因此了解產(chǎn)品基質(zhì)非常重要。確定最佳稀釋倍數(shù)之后，就可以進(jìn)行產(chǎn)品驗(yàn)證。
產(chǎn)品驗(yàn)證程序：確保穩(wěn)健性和合規(guī)性
產(chǎn)品驗(yàn)證包括以最佳稀釋倍數(shù)測試3個(gè)不同批次的產(chǎn)品。這種多批次測試可以確保內(nèi)毒素檢測方法在測試不同批次產(chǎn)品時(shí)的一致性和穩(wěn)定性，符合良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）和法規(guī)要求。
Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀是細(xì)菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域的一項(xiàng)重大的技術(shù)進(jìn)步，為持續(xù)進(jìn)行的產(chǎn)品驗(yàn)證需求提供了全面、高效、合規(guī)的解決方案，提高了產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量。
參考文獻(xiàn)
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